Kromatografi Kertas dan KLT

Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner (diam), dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak). Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang fase stasioner. Fase diam cenderung menahan komponen campuran, sedangkan fasa gerak cenderung menghanyutkannya.

Komponen  utama kromatografi adalah fasa stationer (diam) dan fasa mobil (gerak), dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel 1.1

Tabel 1.1 Klasifikasi kromatografi

Kriteria	Nama
Fasa mobil	Kromatografi cair, kromatografi gas Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi
Mekanisme	Kromatografi pertukaran ion kromatografi gel
Fasa stationer	Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,kromatografi kertas

1.        

2.        

2.1.       Kromatografi kertas

Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan kromatografi kertas telah dikerjakan dimana prosesnya dikenal sebagai “analisis kapiler”. Metode-metode seperti ini sangat bersesuaian dengan kromatografi serapan, dan sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai perkembangan dari system partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

2.1.1.          Pengertian Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan - cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini sangat sederhana.

2.1.2.          Prinsip Kromatografi Kertas

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

1.           

2.           

2.1.           

2.1.1.           

2.1.2.           

2.1.3.          Mekanisme Kromatografi Kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu glukosa.

Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa.
Cara melakukannya, cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan / diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).

Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau nodayang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi – pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa -senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.

Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.

Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.

Rf     =   Jarak titik tengah noda dari titik awal

Jarak tepi muka pelarut dari titik awal

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:

1)        Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan - perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan - perubahan harga Rf.

2)        Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.

3)        Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen - komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.

4)        Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam - macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.

5)        Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

      

 

Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Kromatografi dua dimensi

2.1.4.          Jenis Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas ada dua jenis yaitu :

1)        Kromatografi kertas satu arah

Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Sampel tinta diteteskan pada garis dasar pinsil pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut dalam jumlah yang minimum dalam pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis yang sama.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri pada bawah wadah. Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.

2)        Kromatografi kertas dua arah

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa. Waktu ini kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang ditempatkan ke depan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas.

Sangat menarik untuk mencoba menjelaskan kromatografi kertas dalam kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan kertas. Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-molekul air yang berikatan pada permukaan.Interaksi ini dengan air merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

                        

2.2.       Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai peunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

2.2.1.          Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis  (KLT) adalah suatu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana.

Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut.

1.           

2.           

2.1.           

2.2.           

2.2.1.           

2.2.2.          Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum digunakan adalah silika gel, baik yang normal fase maupun reversed fase

Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda.

2.2.2.           

2.2.3.          Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia.  Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan  berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal).  Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok.

     

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan   sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai pemisahan.  Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana  dan lain- lain. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.

                                

                                 Rf     =  Jarak titik pusat bercak dari titik awal

                                                Jarak garis depan dari titik awal

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf  adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 – 100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan.

Sifat – sifat umum dari penyerap -  penyerap untuk kromatografi lapis tipis yaitu besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron . Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan diberi nama dengan kode silika gel G.

 

   Gambar Kromatografi Lapis Tipis

Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul -molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawa -senyawa polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul seperti asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga dapat digunakan sebagai adsorben.

Zat yang paling umum digunakan sebagai adsorben adalah alumina, silica gel, dan bubuk silica. Zat - zat tersebut dibuat bubuk tepung yang selanjutnya tersebar di atas lempeng dan dibuat sedemikian rupa hingga ketebalannya merata. Kadang - kadang suatu pengikat, misalnya plaster parte ditambahkan untuk menambah daya lekat zat tersebut. Setelah kering, selanjutnay diaktivasi dengan pemanasan dalam oven pada temperature 110^oC selama beberapa jam. Cara kerjanya sama dengan kromatografi kertas. Deteksi terhadap noda timbul kadang-kadang lebih mudah dibandingkan kromatografi kertas karena dapat dipakai cara-cara yang lebih umum.

Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si.

Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarut - pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak diharapkan.

          Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :

1)        Alkaloid

2)        Antraglikosida

3)        Arbutin

4)        Glikosida Jantung

5)        Zat pahit

6)        Flavonoid

7)        Saponin

8)        Minyak atsiri

9)        Kumarin dan asam fenol karboksilat

10)    Valepotriat

Pereaksi penampak

Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat.

a)         Anisaldehid-asam sulfat P

Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.

b)        Dragendroof

Untuk mengamati alkaloid.

c)         Antimon (III) klorida

Untuk mengamati glikosida jantung, saponin.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :

a)         Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 110⁰C selama 30 menit.

b)        Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.

c)         Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.

d)        Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.

e)         Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.

2.2.4.          Noda Pada Kromatografi Lapis Tipis

Mekanisme panampakan noda pada UV yaitu suatu molekul yang mengabsorbsi cahaya ultraviolet akan mencapai suatu keadaan tereksitasi dan kemudian memancarkan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak pada waktu kembali ke  tingkat dasar (emisi), emisi inilah yang digambarkan sebagai fluoresensi.

Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga menghasilkan kecepatan yang berbeda - beda saat terpartisi dan terjadilah pemisahan. Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran. Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran dapat ditambah.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :

a.    Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan

b.    Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.

c.    Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

d.   Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak

e.    Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan

f.     Teknik percobaan, Arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.

g.    Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan.

h.    Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,

i.      Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

·      Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat

·      Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa

·      Lempeng yang tidak rata

2.2.5.          Kelebihan dan Manfaat Kromatografi Lapis Tipis

a.       Kelebihan Kromatografi Lapis Tipis

Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis yaitu :

·      lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas,

·      untuk menyempurnakan pemisahan,

·      lempeng dapat dibuat dengan campuran adsorben yaitu campuran homogen dari beberapa adsorben, satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda, satu lempeng dilapisi dengan campuran dua adsorben dengan konsentrasi bervariasi dari 0 % ke 100 % untuk adsorben yang satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain dan sebaliknya,

·      area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa.

1.          

2.          

2.1.          

2.2.          

2.2.1.          

2.2.2.          

2.2.3.          

2.2.4.          

2.2.5.          

2.2.5.1.          

b.         Manfaat Kromatografi Lapis Tipis

Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :

·      Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.

·      Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.

·      Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.

·      Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.