Isolasi dan Inokulasi Mikroba

Pengertian

Isolasi suatu mikrobia ialah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono, 1980). Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru diperlukan ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri (Dwijoseputro, 1987).

Mikrobia yang hidup di alam terdapat sebagai populasi campuran dari bebagai jenis mikrobia yang berbeda prinsip dari isolasi mikrobia dalam memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari lingkungannya dialam dan ditumbuhkan dalam medium buatan. Pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dalam medium padat, karena dalam medium padat sel-sel mikroba akan terbentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutejo dkk, 1991).

Menurut Pradhika (2008), ada beberapa teknik isolasi mikrobia, yaitu :

1.                  Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

2.      Spread plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Prosedur kerjanya adalah suspensi cairan diambil sebanyak 0,1 ml dengan mikropipet kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Trigalski kemudian dibakar diatas bunsen dan didinginkan beberapa detik. Kemudian suspensi diratakan dengan menggosokannya pada permukaan agar , penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

            

3.      Pour plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya terdapat pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa diketahui sel yang dapat tumbuh dipermukaan agar yang kaya O₂ dan di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung O₂. Prosedur kerjanya adalah petridish, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair disiapkan. Kemudian 1 ml suspensi bakteri diteteskan secara aseptis ke dalam cawan kosong_· Lalu medium yang masih cair dituang ke dalam petridish lalu petridish di putar membentuk angka 8 agar suspensi bakteri dan media homogen, kemudian diinkubasi.

  

Pada spread plate diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml dan pada pour plate diteteskan sebanyak 1 ml karena spread plate bertujuan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

4.      Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

5.      Goresan Sinambung

Prosedur kerjanya adalah inokulum loop (ose) disentuhkan pada koloni bakteri dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Lalu petridish diputar 180^o dan dilanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

6.      Goresan T

Prosedur kerjanya adalah petridish dibagi menjadi 3 bagian menggunakan spidol dan daerah tersebut diinokulasi dengan streak zig-zag. Ose dipanaskan dan didinginkan, lalu distreak zig-zag pada daerah berikutnya.

7.      Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal

Inokulasi bakteri dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang murni. Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan.

Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur murni saja.

Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :

1.       Metode gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.

Ada beberapa teknik menggores yang biasa digunakan : 

2.       Metode tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.

3.       Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

4.       Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni, 1997).

 Macam-Macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1.                  Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme.

2.                  Plate culture: media padat dalam petridish.

3.                  Slant culture : media padat dalam tabung reaksi.

4.                  Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara penusukan.

5.                  Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

6.                  Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.

Populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks. Beratus-ratus spesies pelbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa besarnya. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme.

Alam sekitar kita, udara, tanah, dan air juga dihuni kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisah-misahkan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk.(1;85)

Isolasi adalah merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni, sehingga biakan tersebut disebut kultur murni. (2;28).

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi, yakni masuknya mikroorgasnisme yang tidak kita inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai berikut:

1.      Menyiapkan ruangan

Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu kotak berkaca (enkas).

2.      Pemindahan dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu juga dipanasi setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

3.      Pemindahan dengan Pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu. Untuk itu diambillah 1 ml sampel untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang disterilkan. Dalam pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair. Lalu agar-agar yang masih encer dituangkan di cawan petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan petri yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya dalam inkubator.

4.      Teknik biakan murni (Cara Menyendirikan Biakan Murni)

Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain. Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba (saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. (3;64-65)

Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:

a.       Cara Pengenceran

Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, diambil lagi untuk disebarkan pada suatu medium padat. Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal demikian, kita telah memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnua spesies ini dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni).

b.      Cara Penuangan

Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam satu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing dapat dianggap murni.

c.       Cara Penggesekan / Penggoresan

Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.

Ada beberapa teknik penggesekkan, yakni :

o   Goresan T

§  Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri

§  Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung

§  Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II

§  Pijarkan kembali ose, Prosedur  di atas diulangi untuk daerah III

o   Goresan kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4.

o   Goresan radian

§  Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan

§  Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali

§  Putar lempengan agar 90⁰ dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan

§  Putar lempengan agar 90⁰ dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya

§  Pijarkan ose

o   Goresan sinambung

§  Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar

§  Jangan pijarkan ose,putar lempengan 180⁰ ,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar

d.      Cara penyebaran

Pengenceran sampel seperti pada cara penuangan.,Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan sampel pada permukaan agar.Penyebaran cairan contoh(sampel)dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut.

e.       Cara pengucilan satu sel(sinle cell isolation)

Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri,dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.,Alat semacam ini tidak mudah untuk menggunakannya.Alat iu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu mikromanipulator.(3;65-69)

Flora mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Sesungguhnya ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu: Metode cawan gores dan Metode cawan tuang (4;62-69)

Suspensi mikrobmikroba digoreskan pada agar lempengan, agar miring atau media cair. Sifat biakan dari suatu mikroorganisme tergantung pada penampilannya pada berbagai media. Ciri berikut ini digunakan untuk mengevaluasi biakan:

§  Agar Miring

Sifat pertumbuhan pada agar miring terlihat sebagai tidak ada, sedikit, atau subur. Pengamatan pembentukan warna koloni. Mikroba yang tumbuh dengan subur diatas permukaan suatu media akan telihat lebih buram dibanding dengan pertumbuhan yang tidak subur.

§  Media Cair

Sifat pertumbuhan pada bagian permukaan, dibawah permukaan dan dasar tabung dapt terlihat dengan jelas. Pada beberapa mikreoba terlihat pembentukan partikelyang tebal pada lapisan pemukaan. Dibawah lapisan permukaan dapat terlihat pertumbuhan yang keruh,bergranula, atau flokulen, sedangkan pada bagian dasar kadangkala terlihat sedimenberupa granula kental atau terdiri dari partikel besar.

§  Agar lempengan

Koloni yang tumbuh diatas lempeng perlu diperhatikan warna, sifat tembus cahaya, pinggiran, sifat permukaan dan bentuknya. (5;78-79)

Kunci pokok dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme termasuk bakteri adalah adanya kultur murni hasil isolasi mikroorganisme, sehingga identifikasi dapat berhasil dengan baik, apabila diperoleh isolat yang telah murni. Kultur murni adalah suatu koloni yang berasal dari satu sel mikroorganisme atau bakteri. Kebanyakan identifikasi sangat tergantung dari raksi-reaksi positif atau negatif yang spesifik yang disebabkan oleh suatu kultur murni. Adanya pencemaran mikroorganisme lain, akan menyebabkan hasil uji dapat positif atau negatif palsu. Sehingga dalam mikrobiologi klinik akan memperoleh hasil diagnosa salah atau palsu. (6;322)

Begitu pentingnya kultur murni dalam identifikasi mikroorganisme (bakteri), maka cara-cara untuk memperoleh kultur menjadi sangat fundamental bagi bidang mikrobiologi. Cara termudah untuk memperoleh kultur murni adalah dengan cara penanaman dalam plat agar secara goresan atau dengan taburan. Sel inokulum akan tersebar diatas media agar sedemikian rupa, sehingga koloni yang tumbuh merupakan koloni yang berasal dari satu sel. Koloni-koloni tersebut selanjutnya digoreskan kembali pada medium agar yang lainnya untuk mengecek kemurniannya. (6;323)

Cara lain untuk mempermudah mengenal kultur murni adalah dengan menggunakan media differensial. Suatu reaksi dengan medium memungkinkan differensiasi antara dua atau lebih mikroorganisme. Mikroorganisme yang diinginkan mungkin tidak terbedakan, tetapi kemungkinan-kemungkinan akan memperkecil kelompok yang dicari. (6;325)

Bacillus Subtilis diasosiasikan dengan keracunan makanan dan bermacam infeksi, seperti septicemia, Panophthalmitis, Pneumonia, infeksi luka dan seritonitis. Koloni bacillus subtilis adalah besar dan biasanya berpigmen kuning atau merah jambu sampai oranye atau coklat.

Bacillus merupakan sel berbentuk batang dengan ukuran 0,3-2,2 µm x 1,27-7,0 µm. sebagian besar motif flagellum khas lateral membentuk endospora; tidak lebih dari satu dalam satu sel sporangium. Gram positif. Metabolism dengan respirasi sejati-Fermentasi sejati atau kedua-duanya yaitu respirasi dan fermentasi. Aerobik sejati atau anaerobic fakultatif. Umum dijumpai dalam tanah.